液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）是表征蛋白質(zhì)組的關(guān)鍵工具。然而，其工作流程（包括將蛋白質(zhì)酶解為肽段、通過液相色譜進(jìn)行分離以及利用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定）通常耗時(shí)且技術(shù)要求較高。在完成純化、定量及均一化步驟后，需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解及樣本純化，以制備適用于LC-MS分析的樣本（圖1）。自動(dòng)化這些工作流程可顯著提升通量和可重復(fù)性。本研究采用 Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站的兩套流程，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)酶解及 SP3 樣本純化步驟的自動(dòng)化。

圖 1. Opentrons Flex 自動(dòng)化樣品制備工作流程示意圖。

Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站

1 實(shí)驗(yàn)方法

本項(xiàng)研究采用兩個(gè)公開的運(yùn)行程序，在 Opentrons Flex 平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶酶解及樣本純化的自動(dòng)化操作（圖2）。蛋白質(zhì)酶解方案首先將10 μg單克隆抗體（溶于100 μL 100 mM 碳酸氫銨的純化重組兔 IgG）與10 μL二硫蘇糖醇（DTT；60 mM）混合，隨后在儀器搭載的熱循環(huán)模塊中于55°C孵育30分鐘使蛋白質(zhì)樣本變性。繼而向每個(gè)樣本中加入10 μL碘乙酰胺（IAA；187.5 mM），并于室溫下再次孵育30分鐘以完成烷基化反應(yīng)。最后向每個(gè)樣本中加入10 μL質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶（MS-grade trypsin；0.2 μg/μL），在熱循環(huán)模塊中37 °C孵育16小時(shí)進(jìn)行溶液內(nèi)胰蛋白酶酶解。

圖 2. Opentrons Flex自動(dòng)化蛋白質(zhì)酶解與純化的甲板布局示意圖

基于Opentrons Flex的胰蛋白酶酶解工作流程的甲板布局示意圖
? 板位A1與B1 - Opentrons Tough 96 孔全裙邊PCR板（200 μL）的熱循環(huán)模塊
? 板位A2至D2 - Opentrons 24 孔離心管架（搭配 NEST 1.5 mL 離心管，24×4） 或者板位A2 - Opentrons Tough 96 孔全裙邊PCR板（200 μL）
? 板位B3 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（200 μL）
? 板位C3 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（200 μL）
? 板位D3 - NEST 96 孔深孔板（2 mL）

基于Opentrons Flex的酶解后樣本純化工作流程的甲板布局示意圖
? 板位A1與B1 - 搭載Opentrons Tough 96 孔全裙邊PCR板（200 μL）（含酶解后樣本）的熱循環(huán)模塊?
? 板位C1 ? NEST 單孔儲(chǔ)液槽（290 mL）
? 板位D1 - 熱振蕩模塊，搭載Opentrons 96孔深孔板適配器及NEST 96 孔深孔板（2 mL）?
? 板位A2 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（1000 μL）
? 板位B2 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（1000 μL）?
? 板位C2 - 環(huán)形磁力架
? 板位D2 - NEST 單孔儲(chǔ)液槽（290 mL）?
? 板位A3 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（200 μL）
? 板位B3 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（200 μL）?
? 板位C4 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（200 μL）
? 板位C3 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（200 μL）

基于 Opentrons Flex 的自動(dòng)化 SP3 脫鹽流程與 LC-MS 分析結(jié)果
蛋白質(zhì)酶解完成后，Opentrons Flex 即刻執(zhí)行了自動(dòng)化 SP3 脫鹽方案。簡(jiǎn)言之，酶解后樣本從熱循環(huán)模塊轉(zhuǎn)移至熱振蕩模塊上的新工作板中，并與10 μL磁珠懸液（Cytiva Sera-Mag 羧基修飾磁珠；50 μg/μL）及乙腈（ACN, 1292 μL）混合以實(shí)現(xiàn)肽段捕獲。通過磁分離收集磁珠，隨后使用ACN（1000 μL）進(jìn)行洗滌。肽段在2% DMSO（80 μL）中被洗脫。最終產(chǎn)物在儀器外進(jìn)行真空干燥。LC-MS 分析顯示，在各樣品間基峰離子色譜圖模式高度一致，并且能夠可靠地檢測(cè)到與兔 IgG 亞基相關(guān)的蛋白質(zhì)。（圖3）。

表 3.三批經(jīng)純化與均一化的單克隆抗體樣本進(jìn)行酶解與脫鹽處理（樣本 #1 和 #4、#2 和 #5、#3 和 #6 分別為同一批次的一式兩份），并于紐約市立大學(xué)高級(jí)科學(xué)研究中心的 Bruker maXis-II ETD ESI-QqTOF/Dionex Ultimate-3000 LC 系統(tǒng)進(jìn)行分析。
圖中展示了基峰強(qiáng)度色譜圖（離子流強(qiáng)度 vs. 保留時(shí)間）（左上）及檢測(cè)到的蛋白質(zhì)（右上）。

結(jié)論

Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站及公開可用的實(shí)驗(yàn)方案可用于實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)酶解與 SP3 樣本純化的自動(dòng)化操作，并獲得理想的樣本處理質(zhì)量。該方法為常規(guī)實(shí)驗(yàn)任務(wù)提供了便捷的解決方案，有助于降低人力需求，或?qū)⑵湔系交?LC-MS 的蛋白質(zhì)組學(xué)分析的復(fù)雜工作流程當(dāng)中。