需要免疫沉淀的工作流程

• 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究： 鑒定和驗(yàn)證與相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。
• 翻譯后修飾分析： 富集具有特定修飾（如磷酸化或泛素化）的蛋白質(zhì)。
• 功能測(cè)定： 在受控環(huán)境中研究蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物的活性。

免疫沉淀的最佳方法

免疫沉淀（Classic Immunoprecipitation, Classic IP）

從復(fù)雜混合物中分離出特定蛋白質(zhì)，用于研究其特性、翻譯后修飾或進(jìn)一步分析。

1. 使用裂解緩沖液裂解細(xì)胞以釋放蛋白質(zhì)。
2. 將針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)定制的特異性抗體附著在珠子（瓊脂糖或磁性）上。
3. 細(xì)胞裂解液與抗體-磁珠復(fù)合物孵育，使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合。
4. 使用洗滌緩沖液洗去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
5. 然后使用洗脫緩沖液將目標(biāo)蛋白質(zhì)從珠子上洗脫下來(lái)。
6. 使用離心機(jī)或磁力架從裂解液中分離出與抗體珠結(jié)合的蛋白質(zhì)。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）

從復(fù)雜的生物樣本中分離出主要蛋白質(zhì)及其潛在的相互作用伙伴，從而研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。

1. 細(xì)胞裂解以釋放蛋白質(zhì)。
2. 將針對(duì)原生蛋白定制的特異性抗體附著在珠子上。
3. 細(xì)胞裂解液與抗體-珠子復(fù)合物一起孵育。
4. 在此步驟中，與原生蛋白相互作用的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生共沉淀。
5. 非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)會(huì)被洗去。
6. 原生蛋白及其相互作用蛋白被洗脫。
7. 使用離心機(jī)或磁力架分離與抗體珠結(jié)合的蛋白質(zhì)。

串聯(lián)親和純化 (Tandem Affinity Purification, TAP)

實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的高純度純化，尤其適用于研究低豐度或瞬時(shí)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

1. 對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行基因改造，使其包含雙標(biāo)記系統(tǒng)。
2. 對(duì)表達(dá)這種修飾蛋白的細(xì)胞進(jìn)行裂解。
3. 首先將裂解液與與第一個(gè)標(biāo)簽結(jié)合的珠子孵育，分離出蛋白質(zhì)。
4. 使用特定的蛋白酶將第一個(gè)標(biāo)簽裂解掉。
5. 使用與第二個(gè)標(biāo)簽結(jié)合的珠子進(jìn)行第二輪純化。
6. 經(jīng)過(guò)這一步驟后，蛋白質(zhì)復(fù)合物被洗脫出來(lái)，純度很高。
7. 使用離心機(jī)分離與珠子結(jié)合的蛋白質(zhì)。

為什么免疫沉淀很困難：

• 特異性問(wèn)題： 蛋白質(zhì)與珠子或抗體的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。
• 靈敏度問(wèn)題： 低豐度蛋白質(zhì)可能無(wú)法被有效吸附，從而導(dǎo)致假陰性。
• 維持蛋白質(zhì)相互作用： 有些蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用是瞬時(shí)或微弱的，因此在 IP 過(guò)程中捕獲并維持這種作用具有挑戰(zhàn)性。

如何實(shí)現(xiàn)免疫沉淀過(guò)程的自動(dòng)化：

• 液體處理工作站： 這些工作站可自動(dòng)添加和移除溶液，確保移液的一致性和精確性。
• 磁珠分離： 自動(dòng)化平臺(tái)可處理磁珠分離，減少操作時(shí)間并提高一致性。
• 整合系統(tǒng)： 有些平臺(tái)將樣品制備、IP 和下游分析（如質(zhì)譜）整合到一個(gè)工作流程中。

免疫沉淀自動(dòng)化比手動(dòng)移液的優(yōu)勢(shì)：

• 一致性和可重復(fù)性： 自動(dòng)化減少了人為錯(cuò)誤和可變性。
• 通量： 自動(dòng)化系統(tǒng)可同時(shí)處理多個(gè)樣品，提高效率。
• 降低污染風(fēng)險(xiǎn)：盡量減少人工操作，降低樣品污染的幾率。
• 優(yōu)化方案： 自動(dòng)化系統(tǒng)通常帶有優(yōu)化的操作程序，可確保獲得最佳結(jié)果。