摘要
利用Opentron的OT-2和平臺，我們展示了一種高度敏感、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的管道，用于基于pcr的SARS-CoV-2檢測。

主要發(fā)現(xiàn)
.該管道可以在所有目標(biāo)上檢測到微量病毒至0.5拷貝/μLwith，≥準(zhǔn)確率為96%，表明OT-2的靈敏度可與其他自動化系統(tǒng)媲美。
.一個冠狀病毒交叉反應(yīng)性小組展示了該病毒與SARS、MERS和人類冠狀病毒229E相比，SARS-冠狀病毒2檢測的特異性，NL63和OC43。
.在3小時內(nèi)完成了96個樣本的病毒RNA提取，平均閾值周期（Ct）為36個，平均標(biāo)準(zhǔn)差為1.0，平均變異系數(shù)（CV）為2.8%。

介紹
由SARS-CoV-2引起的COVID-19世界衛(wèi)生宣布全球大流行。
2020年3月11日的組織機(jī)構(gòu)(1)。從那時起，那里一直是全球?qū)Υ笠?guī)模發(fā)展的高度重視，高通量測試。而許多預(yù)防措施諸如社交距離和口罩強(qiáng)制要求等措施已在世界上許多國家得到執(zhí)行，大規(guī)模檢測已被證明是最大限度地減少疾病傳播和對全球經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生的威脅的有力選擇。如南方的國家
韓國(2)和新加坡(3)已經(jīng)擴(kuò)大了非凡的測試工作，并已成為遏制的模式疾病預(yù)計還會有一種可靠的疫苗，還有幾個月的時間（4個）和大量的測試選擇顯示出很高的假陰性率（5個），增加可靠的測試選項(xiàng)的數(shù)量是至關(guān)重要的。

在本研究中，我們舉例說明了一個簡單和可重復(fù)的方法
使用Opentrons OT-2、模塊和實(shí)驗(yàn)室軟件的基于SARS-CoV-2 RT-PCR的檢測策略。這種自動友好的工作流程是非常敏感的，令人難以置信的實(shí)惠，并且可以對增加測試提供不可估量的幫助
全球能力。

材料和方法
合成SARSCoV-2 RNA對照2（Twist生物科學(xué)）和合成，合成陽性樣本。鼻基質(zhì)（SNM）(6)，每個樣本包含200個μL裂解緩沖液和35 μL蛋白酶K（PK）。SNM與Nuttada等人(6)中概述的內(nèi)容類似。(SNM： 110 mM氯化鈉，1% w/v粘蛋白從豬胃II型（Sigma M2378-100G）和10 μg/mL w/v人類基因組DNA（Coriell NA12878）在90% v/v的TE/SNMEeach樣品在室溫下孵育15分鐘進(jìn)行裂解。

RNA提取使用Promega進(jìn)行?HT病毒TNA試劑盒，裂解后立即發(fā)生。在樣品中加入珠子和異丙醇后，在OT-2上暫停發(fā)生了混合盤子10分鐘的關(guān)閉甲板渦旋器。一旦混合完成，OT-2每個樣品在65 μL中洗脫。. 這個OT-2在左側(cè)使用了gen2p300 8通道移液管安裝多達(dá)10個200 μL過濾器運(yùn)行，包括GEN2磁性模塊和GEN2溫度模塊（圖1）?？傔\(yùn)行時間，包括動手操作時間和裂解時間，在1小時到3.5小時之間變化（圖2）。

美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）的引物和探針：
.2019-nCoV_N1-F (GACCCCAAAATCAGCGAAAT)
.2019-nCoV_N1-R (TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG).2019-nCoV_N1P (FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1)
?2019-nCoV_N2-F (TTACAAACATTGGCCGCAAA)
?2019nCoV_N2-R (GCGCGACATTCCGAAGAA)
?2019-nCoV_N2-P (FAMACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGBHQ1)
?RP-F (AGATTTGGACCTGCGAGCG)
?RP-R (GAGCGGCTGTCTCCACAAGT)
?RP-P (FAM-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1)

它們是從集成DNA技術(shù)公司訂購的（IDT，2019-nCoV CDC EUA試劑盒）。N1、N2和RNase P以推薦的濃度進(jìn)行預(yù)混2019-由CDCnCoV N 陽性對照(GenBank：NC_045512.2)和Hs_RPP30陽性對照均來自IDT，分別用于SARS-CoV-2陽性對照和人RNA陽性對照。一步入門版?III RT-PCR試劑盒（Takara Bio Inc.）

在Takara或Luna?通用探針一步RT-qPCR試劑盒（NEB）以Lista、Maria Jose等人測試的推薦濃度使用(7)。下面的程序是否進(jìn)行RT-PCR檢測：逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果為在55°C下進(jìn)行10分鐘。初始變性是在95°C下變性1分鐘，然后在95°C下變性50次循環(huán)10秒，然后退火30秒60°C.

柏林Charite/世界衛(wèi)生組織（WHO）的引物和探針：
?E_Sarbeco_F1 (ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT)
?E_Sarbeco_R2 (ATATTGCAGCAGTACGCACACA)
?E_Sarbeco_P1 (FAM-ACACTAGCTCATCCTTACTGCTTCGBBQ)
?RdRP_SARSr-F2 (GTGARATGGTCATGTGTGGCGG)

圖1：易于采用基于SARS-CoV-2pcr的檢測管道A。
該管道從合成樣品開始。在……之后將樣品重新格式化為NEST 96深井板2 mL，樣品在室溫下保存15分鐘進(jìn)行裂解，然后使用視轉(zhuǎn)子GEN2磁性模塊和GEN2溫度模塊對OT-2進(jìn)行RNA提取。最后，在RT-qPCR機(jī)器上進(jìn)行RT-PCR。B.OT-2上的這個布局包括GEN2p300 8通道移液管、GEN2溫度模塊和GEN2磁性模塊。實(shí)驗(yàn)室軟件的要求包括多達(dá)10個200μL過濾頂，1個NEST 1井水庫195 mL，一個NEST2 mL深井板，兩個NEST 12井水庫15 mL，一個NEST96孔板100μL PCR全裙?？偟膩碚f，每個樣本的總?cè)斯ぶ破烦杀緸?4.35美元。

圖2：快速完成在Opentrons OT-2上的COVID測試。
準(zhǔn)備時間和樣本重新格式化的時間在10分鐘到40分鐘之間，這取決于吞吐量。裂解的時間總是15分鐘。運(yùn)行時間，描述為OT-2執(zhí)行運(yùn)行所需的時間，在8個樣本的37分鐘到96個樣本的2小時到38分鐘之間變化。總的來說，96個樣品可以在大約3.5小時內(nèi)準(zhǔn)備和提取。

原文地址：負(fù)擔(dān)得起的COVID-19測試使用OT-2的自動化