在自下而上的液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，需將蛋白質(zhì)酶解為肽段，經(jīng)液相色譜（LC）分離后，再利用質(zhì)譜（MS）進(jìn)行鑒定。該流程通常涉及多個(gè)上游樣品制備步驟（圖1），包括目標(biāo)蛋白的分離純化、定量、歸一化處理、蛋白質(zhì)酶解及樣品純化。
這些步驟雖至關(guān)重要，卻耗費(fèi)研究人員大量時(shí)間和人力。通過自動(dòng)化技術(shù)處理上述流程，不僅能顯著提升實(shí)驗(yàn)效率與通量，還可提高結(jié)果的可重復(fù)性。本研究基于 Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站，實(shí)現(xiàn)了單克隆抗體（mAb）樣本的磁珠法蛋白質(zhì)純化，最終 獲得的純化樣品可直接用于后續(xù)LC-MS分析。

Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站

1 實(shí)驗(yàn)方法
樣品處理：取三份來自 HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)上清的分泌單克隆抗體 (mAb) （細(xì)胞均表達(dá)兔源 IgG 與 GFP，參見圖 2），分別加入 96 孔板的三個(gè)獨(dú)立垂直列中（每孔 250 μL，每列 8 孔）

圖 1. Opentrons Flex 自動(dòng)化樣品制備工作流程示意圖。

圖 2. HeLa 細(xì)胞轉(zhuǎn)染示意圖。
細(xì)胞通過攜帶兔源 IgG 和 GFP cDNA 的載體轉(zhuǎn)染 72 小時(shí)，通過熒光顯微鏡觀察 GFP 表達(dá)確認(rèn)兩者共表達(dá)。
在 Opentrons Flex 上執(zhí)行了自動(dòng)化蛋白質(zhì)純化（圖 3）。首先使用平衡緩沖液（200 μL）漂洗 Dynabeads? Protein G 磁珠懸液（50 μL，ThermoFisher Scientific，Waltham, MA），隨后將其與各樣品（每份 200 μL）混合。將混合液置于置于集成式加熱振蕩模塊上振蕩兩小時(shí)以捕獲目標(biāo) mAb。接下來，使用洗滌緩沖液（200 μL）對(duì) Dynabeads-蛋白復(fù)合物進(jìn)行兩次洗滌，最后用洗脫緩沖液（50 μL）洗脫蛋白。

圖 3. Opentrons Flex 自動(dòng)化蛋白質(zhì)純化方案的甲板布局示意圖。從同一細(xì)胞培養(yǎng)物收集的洗脫液經(jīng)合并后，進(jìn)行 SDS-PAGE 及Western blot 分析。結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白成功富集（圖 4 上圖），并證實(shí)了 mAb 的存在（圖 4 下圖）。

• 板位 D1 - 熱振蕩模塊及適配器（放置 NEST 96 孔深孔板，2 mL）
• 板位 D2 - NEST 單孔儲(chǔ)液槽（290 mL）
• 板位 D3 - 溫控模塊及適配器（放置 NEST 96 孔深孔板，2 mL）（若最終產(chǎn)物不立即進(jìn)行 SDS-PAGE 分析）
• 板位 C1 - 環(huán)形磁力架
• 板位 C2 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（1000 μL）
• 板位 C3 - NEST 12 孔儲(chǔ)液槽（15 mL）（1 號(hào)孔：磁珠懸液，2 號(hào)孔：抗體 溶液，3 號(hào)孔：洗脫緩沖液）
• 板位 B1 - NEST 12 孔儲(chǔ)液槽（15 mL）
• 板位 B2 - NEST 96 孔深孔板（2 mL）
• 板位 B3 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（1000 μL）
• 板位 A1 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（1000 μL）
• 板位 A2 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（1000 μL)

圖 4. 通過 SDS-PAGE 和 Western blot 確認(rèn)各洗脫液中純化的兔源 IgG。純化后，非靶標(biāo)蛋白水平顯著降低（上圖）。使用IRDye?680RD山羊抗兔IgG二抗（LI-COR ?Biosciences, Lincoln, NE）檢測(cè)兔源 IgG 的存在（下圖）。

結(jié)論

Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站及其開源協(xié)議可用于實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)純化的自動(dòng)化流程，包括收集來自蛋白表達(dá)系統(tǒng)的重組單克隆 抗體（mAb），以用于研究或臨床應(yīng)用。自動(dòng)化方案為常規(guī)實(shí)驗(yàn)任務(wù)提供了便捷的解決方案，既可顯著降低人力需求，亦可支持在基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)分析中集成復(fù)雜的工作流程。