蛋白質(zhì)酶解與純化處理是基于質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中獲得高質(zhì)量肽段的關(guān)鍵步驟。該過(guò)程耗時(shí)耗力。為了能實(shí)現(xiàn)多樣本同步分析、提高通量并減少批次間差異，有時(shí)候會(huì)使用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）進(jìn)行樣本多重標(biāo)記，這進(jìn)一步增加了實(shí)驗(yàn)臺(tái)操作的復(fù)雜性。

肽段樣本制備的實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化可顯著減少手動(dòng)操作時(shí)間，最大限度降低人為錯(cuò)誤風(fēng)險(xiǎn)，并提高通量。本文介紹一種在 Opentrons Flex 平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)的全自動(dòng)工作流程，用于胰蛋白酶/Lys-C 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)酶解、基于磁珠的純化處理，以及使用市售試劑盒進(jìn)行 TMT 標(biāo)記。

Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站

一 實(shí)驗(yàn)方法

1. 將樣品（純化的牛血清白蛋白 BSA 或 HeLa 細(xì)胞裂解液）、試劑（EasyPep Magnetic MS Sample Prep Kit 和 TMT Mass Tagging Kit，Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）以及配套耗材手動(dòng)裝載至 Opentrons Flex 移液工作站上。
2. 在配備全集成式熱循環(huán)模塊（提供精確溫度控制）的 Opentrons Flex 平臺(tái)上，開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了兩個(gè)操作流程：

3.  通過(guò) LC-MS 分析評(píng)估最終產(chǎn)物的質(zhì)量。

圖 1. 流程 1：蛋白質(zhì)酶解和 TMT 標(biāo)記。Flex 甲板布局（左）和工作流程（右）。

圖 2. 流程 2：樣品純化。Flex 甲板布局（左）和工作流程（右）。

二 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用BSA進(jìn)行流程驗(yàn)證（圖3）  

1、每個(gè)樣本中，純化的牛血清白蛋白（BSA）經(jīng)酶解后，分別用 TMT2-126 或 TMT2-127 等質(zhì)量的同位素標(biāo)記，按1:1比例混合，并經(jīng)脫鹽處理后進(jìn)行 LC-MS 分析。  

2、通過(guò) Opentrons Flex 進(jìn)行的三次獨(dú)立測(cè)試數(shù)據(jù)顯示，TMT 標(biāo)記效率保持穩(wěn)定均一（127/126比值平均值為1.039），與標(biāo)準(zhǔn)手動(dòng)操作流程結(jié)果相當(dāng)。

圖 3. 使用 BSA 進(jìn)行流程驗(yàn)證的圖示 ?

左下角：經(jīng)不同 TMT 標(biāo)記的多肽片段示例； ?
右上角：通過(guò) Opentrons Flex 處理的3次測(cè)試（Flex #1-#3）及按供應(yīng)商方案手動(dòng)處理的1次測(cè)試中，TMT2-127 與 TMT2-126 標(biāo)記的 BSA?酶解產(chǎn)物比值對(duì)比

HeLa 細(xì)胞裂解物的樣品制備（圖 4）

每個(gè)樣品取兩批 HeLa 細(xì)胞裂解物（100 μg）進(jìn)行酶解，分別用 TMT6-127 和 TMTzero 同位素標(biāo)簽標(biāo)記，按 1:1 比例混合后脫鹽，隨后進(jìn)行 LC-MS 分析。
酶解后的肽段被兩種同位素 TMT 完全標(biāo)記（標(biāo)記效率 99%），且兩種標(biāo)記的比例接近 1:1（重標(biāo) / 輕標(biāo)比例≈1）。
在 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中（均使用 Opentrons Flex 處理樣品），基峰色譜圖的良好對(duì)齊及包括多重標(biāo)記效率在內(nèi)的其他數(shù)據(jù)均保持一致。數(shù)據(jù)與手動(dòng)操作流程相當(dāng)，表明該自動(dòng)化工作流程具有較高準(zhǔn)確性。

圖 4.HeLa 細(xì)胞裂解液樣本制備結(jié)果。

左上：基峰色譜圖；右上：兩種 TMT 標(biāo)記肽段比值（TMT6-127：重標(biāo)；TMTzero-126：輕標(biāo)）；右下：使用 Opentrons Flex 處理的3次測(cè)試（Flex #1-#3）及按供應(yīng)商方案手動(dòng)處理的1次測(cè)試的標(biāo)記效率對(duì)比。

結(jié)論

基于 Opentrons Flex 開(kāi)發(fā)的完整肽段制備工作流程，實(shí)現(xiàn)了 TMT 輔助多重 LC-MS 分析的全自動(dòng)化操作，具備良好的一致性、更高通量及優(yōu)質(zhì)樣本處理能力。該自動(dòng)化方案顯著減少了手動(dòng)操作時(shí)間，只需小于10分鐘的試劑準(zhǔn)備和耗材裝載，大大節(jié)省了寶貴的實(shí)驗(yàn)臺(tái)時(shí)間。