分子克隆是合成生物學(xué)的核心，因?yàn)樗?DNA 的組裝及其在靶宿主中的表達(dá)。然而，目前克隆通常是一個手動、耗時且重復(fù)的過程，自動化將極大地促進(jìn)這一過程的發(fā)展。完整的合理克隆過程（即從 DNA 創(chuàng)建到在靶宿主中表達(dá)）的自動化涉及不同操作和機(jī)器的集成。此類工作流程的示例很少，尤其是當(dāng)設(shè)計(jì)合理（即DNA 序列設(shè)計(jì)是固定的，而不是基于隨機(jī)庫）且靶宿主在遺傳上不太易于處理（例如，對熱休克轉(zhuǎn)化不敏感）時。在本研究中，介紹了一種自動化工作流程，用于合理構(gòu)建質(zhì)粒并將其隨后接合轉(zhuǎn)移到生物技術(shù)平臺生物谷氨酸棒狀桿菌中。整個工作流程都配有定制的軟件工具。作為應(yīng)用示例，構(gòu)建并表征了基于調(diào)節(jié)器 Lrp 的合理設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器庫。獲得了具有改進(jìn)的動態(tài)范圍的傳感器，并且從篩選中獲得的見解為谷氨酸棒桿菌Lrp的雙重調(diào)節(jié)功能提供了證據(jù)。

介紹
大宗和精細(xì)化學(xué)品的微生物生產(chǎn)是實(shí)現(xiàn)更可持續(xù)的全球經(jīng)濟(jì)的重要組成部分。為了促進(jìn)這一發(fā)展，必須提高對微生物生命的基本理解及其工程設(shè)計(jì)以滿足社會需求。近年來，人們提出了采用設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí) (DBTL) 循環(huán)作為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的工具。（1）分子克隆在這一循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，因?yàn)樗梢陨删哂胁煌匦缘男禄蛐鸵怨┨剿鳌?br>目前已開發(fā)出多種軟件工具來幫助進(jìn)行基因型的電子克隆，其數(shù)量很容易超過實(shí)驗(yàn)室中手動克隆的數(shù)量。（2）現(xiàn)在，在短時間內(nèi)設(shè)計(jì)數(shù)百種基因型已成為可能。例如，一條由 5 個基因組成的生產(chǎn)途徑，每個基因具有 3 個不同的核糖體結(jié)合位點(diǎn) (RBS)，已經(jīng)產(chǎn)生了 3 5 = 243 種變體。然而，這種項(xiàng)目的設(shè)計(jì)相對簡單，現(xiàn)在瓶頸轉(zhuǎn)移到實(shí)際體外創(chuàng)建這些序列及其在所需工業(yè)宿主中的表達(dá)。（3）
可以通過使用一鍋組裝和篩選方法來解決該問題，即獲得許多但不一定是全部的變體，并使用篩選試驗(yàn)來選擇表現(xiàn)最佳的變體。（4）然而，這些方法有一個缺點(diǎn)：知識僅來自成功構(gòu)建并從一鍋反應(yīng)中分離的少數(shù)變體。更難構(gòu)建的變體在這種反應(yīng)中較少，因此不太可能篩選出它們的特性。對于許多基本的生物學(xué)問題，這不是一個理想的解決方案。在這里，合理的菌株構(gòu)建和工作流程所有步驟內(nèi)所有品種的完整可追溯性是必要的，就像經(jīng)典分子克隆所實(shí)現(xiàn)的那樣。
然而，目前分子克隆通常是一個手動、耗時且重復(fù)的過程，自動化將為其帶來巨大好處。（5）合理克隆工作流程的自動化具有多種好處。實(shí)驗(yàn)人員在菌株構(gòu)建上花費(fèi)的動手時間可以大大減少。再加上可以實(shí)現(xiàn)更高的吞吐量，這大大增加了可以及時生產(chǎn)的構(gòu)建體的數(shù)量。此外，自動化通過消除過程中的隨機(jī)變化引入了流程的標(biāo)準(zhǔn)化。這些過程也可以更容易地監(jiān)控和分析，從而更容易找到改進(jìn)的空間。因此，自動化可以提高克隆工作流程的數(shù)量和質(zhì)量。
近年來，微流體技術(shù)已用于實(shí)現(xiàn)克隆過程的自動化。（6,7）在這里，定制的微流控芯片用于為單個單元操作提供液體分離和液體轉(zhuǎn)移。雖然這種技術(shù)具有將許多單元操作組合在一個設(shè)備中的優(yōu)勢，并且能夠擴(kuò)展到每個芯片進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)，但需要高度專業(yè)的基礎(chǔ)設(shè)施和人員來制造芯片并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
一種更模塊化、更方便的解決方案是使用標(biāo)準(zhǔn)液體處理系統(tǒng)，如果需要，還可以使用輔助設(shè)備。這樣的系統(tǒng)可能相當(dāng)復(fù)雜，能夠執(zhí)行大量具有不同任務(wù)的實(shí)驗(yàn)，（8?11）而且還有更具成本效益的解決方案可供選擇。（12）最近提出的策略利用特定細(xì)菌的自然轉(zhuǎn)化能力，從而產(chǎn)生一種高效且易于使用的克隆方法。（13）然而，這種方法僅限于主動吸收外源 DNA 的少數(shù)生物。
迄今為止發(fā)布的大多數(shù)自動克隆工作流程都集中于大腸桿菌。（14）大腸桿菌是一種成熟的分子克隆宿主，在遺傳學(xué)上非常容易操控。許多遺傳工具已被開發(fā)和優(yōu)化用于大腸桿菌，并且有全面的組學(xué)數(shù)據(jù)可用。然而，由于大腸桿菌的低壓力耐受性和噬菌體感染風(fēng)險，它并不總是工業(yè)過程的理想宿主。（15）因此，擴(kuò)展自動化平臺以涵蓋對其他遺傳上較難處理的微生物進(jìn)行工程改造將是有益的。
谷氨酸棒狀桿菌是一種廣泛使用的工業(yè)細(xì)菌（16）由于其對熱休克轉(zhuǎn)化等自動化友好型轉(zhuǎn)化過程具有抵抗力，因此其改造難度比大腸桿菌更大。雖然已經(jīng)朝這個方向采取了一些措施，（17）它們通常無法實(shí)現(xiàn)實(shí)際目標(biāo)生物轉(zhuǎn)化過程的自動化，最常見的原因是，電穿孔（針對此類生物的首選方法）不易實(shí)現(xiàn)自動化。
本研究提出了一種完整的工作流程，用于自動化合理構(gòu)建抗熱休克微生物菌株。所有工作均使用標(biāo)準(zhǔn)液體處理系統(tǒng)進(jìn)行。PCR 和 Gibson 組裝用于構(gòu)建 96 個質(zhì)粒的文庫。開發(fā)了用于大腸桿菌熱休克轉(zhuǎn)化的自動化方案作為穿梭系統(tǒng)。菌落 PCR 和測序用作質(zhì)量控制。對于轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌的最后一步，開發(fā)了一種新穎的高通量接合工作流程。接合是一種描述良好且高度相關(guān)的細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)。（18）這種方法效率很高，但由于需要使用瓊脂板和濾紙，因此通常比較費(fèi)力。在本研究中，我們通過使用離心法簡化了操作并使其自動化。整個工作流程都配有一個定制的軟件工具，用于跟蹤所有構(gòu)建體及其在過程中的狀態(tài)。
作為應(yīng)用示例，顯示了谷氨酸棒桿菌中不同 Lrp 生物傳感器變體的組裝和表達(dá)。Lrp 生物傳感器之前已開發(fā)用于檢測谷氨酸棒桿菌中的l -蛋氨酸和支鏈氨基酸。(19)該傳感器將細(xì)胞內(nèi)l -蛋氨酸和支鏈氨基酸濃度與eyfp的表達(dá)相結(jié)合，后者編碼一種熒光報告蛋白。細(xì)胞內(nèi)濃度增加會導(dǎo)致熒光信號增強(qiáng)。一般而言，生物傳感器的設(shè)計(jì)相對模塊化；可以通過修改核糖體結(jié)合位點(diǎn)和啟動子長度等來改變其特性。（20,21）此外，通過設(shè)計(jì)，它們提供了基因型和表型之間的直接且易于測量的關(guān)系；即Lrp 傳感器設(shè)計(jì)的變化可能會導(dǎo)致不同的可測量熒光輸出。因此，選擇不同 Lrp 生物傳感器的合理設(shè)計(jì)作為應(yīng)用示例，以展示我們的克隆自動化方法的優(yōu)勢。

結(jié)果與討論
自動化基因工程工作流程
本研究開發(fā)的自動克隆工作流程（圖1）可分為兩個階段：質(zhì)粒在大腸桿菌中的組裝和擴(kuò)增以及將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到目標(biāo)生物體（本例中為谷氨酸棒桿菌）中。質(zhì)粒的構(gòu)建是通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)部件、通過 PCR 構(gòu)建片段以及通過 Gibson 組裝整合到骨架載體中。之所以選擇 Gibson 組裝，是因?yàn)樗试S質(zhì)粒無疤痕組裝。(22)隨后通過熱休克轉(zhuǎn)化為大腸桿菌。將所得克隆通過冷凍保存，并通過菌落 PCR 進(jìn)行第一步質(zhì)量控制。之所以選擇這種方法，是因?yàn)槠涑杀拘б娓咔疫\(yùn)行時間短。該菌落 PCR 的結(jié)果影響了接下來的步驟：只有菌落 PCR結(jié)果為陽性的大腸桿菌克隆，即得到的 DNA 片段具有預(yù)期大小，表明片段成功組裝到主鏈中，才會被考慮用于自動質(zhì)粒制備，并同時結(jié)合到谷氨酸棒桿菌中。純化的質(zhì)粒用于測序作為最終的質(zhì)量控制。之后，篩選自動構(gòu)建的菌株以表征改變的特性。最重要的是，每個單元操作都被設(shè)計(jì)為獨(dú)立的，因此可以在脫離工作流程時使用。

自動化單元操作由低成本液體處理設(shè)備 Opentrons OT-2 和基于前面描述的 Tecan EVO 200 的更復(fù)雜的液體處理平臺執(zhí)行或支持。（23,24）這兩個系統(tǒng)有著根本的不同：??OT-2 使用兩個帶一次性吸頭的空氣置換移液器。可用移液器的容量范圍與手動移液器相似，操作員必須選擇適合實(shí)驗(yàn)的移液器。它沒有機(jī)械手；因此，它不能改變平板的位置，例如，將平板放在加熱塊上或離心機(jī)中。平臺最多可容納九個微量滴定板。本研究使用的模型沒有配備冷卻實(shí)驗(yàn)室器皿的選項(xiàng)。設(shè)計(jì)并 3D 打印了一個可裝滿冰和接頭適配器的定制冷卻架（參見支持信息） ，以便在必要時（例如，用于 Gibson 組裝）冷卻試劑。本研究中使用的配置中的 EVO 200 有一個基于液體的液體處理系統(tǒng)，容量范圍為 3 至 990 μL。它配備了一臺離心機(jī)、一個冷卻載體和一個加熱器/振動裝置，兩者都可供集成的機(jī)器人操縱臂使用。根據(jù)所用的載體，該平臺可以容納 15 個或更多的微量滴定板。為了將細(xì)菌培養(yǎng)物點(diǎn)到 100 毫米圓形培養(yǎng)皿上，我們設(shè)計(jì)了一個定制適配器并進(jìn)行了 3D 打印（參見支持信息）。
決定使用兩種不同的液體處理系統(tǒng)是出于最高效利用實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的需求：只要有可能，就使用 OT-2 進(jìn)行單元操作。與更昂貴的 EVO 200 相比，這節(jié)省了時間，因此可用于要求更高的實(shí)驗(yàn)。在本研究中，單元操作“菌落采摘”是手動完成的。它可以通過專用設(shè)備自動完成，但當(dāng)時沒有這些設(shè)備。
基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器的合理組合設(shè)計(jì)為了證明我們的工作流程的適用性，設(shè)計(jì)、構(gòu)建并在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)了不同版本的 Lrp 生物傳感器。Lrp 生物傳感器將細(xì)胞內(nèi)l -蛋氨酸、l -亮氨酸、l -異亮氨酸和l -纈氨酸濃度與熒光報告蛋白 eYFP 的表達(dá)相結(jié)合。為了構(gòu)建不同版本的 Lrp 生物傳感器，對傳感器的不同部分進(jìn)行了修改。Lrp 生物傳感器由lrp基因（編碼 Lrp 轉(zhuǎn)錄因子）、發(fā)散表達(dá)的eyfp基因（編碼熒光報告基因）和基因間區(qū)（包含lrp啟動子和eyfp上游的brnF啟動子以及eyfp RBS）組成(19)（圖2 ）針對lrp起始密碼子和 RBS、brnF啟動子和eyfp RBS設(shè)計(jì)了不同的變體。

對于lrp起始密碼子，選擇了三種變體：天然起始密碼子 ATG（應(yīng)導(dǎo)致最高表達(dá)）、起始密碼子 GTG（應(yīng)導(dǎo)致較低表達(dá)）和 TGT（應(yīng)導(dǎo)致非常低或無表達(dá)）。這些起始密碼子變體中的每一個都與三種不同的lrp RBS 組合，同樣從最高表達(dá)到最低表達(dá)：GCTAAAATGG（最強(qiáng)）、GCTATTGTGC（天然，較弱）和 CAATCCTACC（最弱）。lrp側(cè)的三個起始密碼子和三個 RBS 的組合產(chǎn)生了 3 × 3 = 9 種不同的引物。
eyfp基因在brnF啟動子的控制下表達(dá)，該啟動子含有 Lrp 蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。(25)因此，當(dāng)啟動子序列縮短或延長時，可以添加或移除結(jié)合位點(diǎn)。由于brnF轉(zhuǎn)錄為無前導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本，并且brnF的第一部分可能具有調(diào)控功能，(26)標(biāo)準(zhǔn)Lrp傳感器的eyfp啟動子包含brnF的前30bp 。本研究設(shè)計(jì)了四種不同的變體，從+30（標(biāo)準(zhǔn)Lrp生物傳感器啟動子）開始，以15為步長設(shè)計(jì)縮短版本，即+15、0和?15。對于eyfp的RBS，選擇了三種變體：AAAAGGAGAT（最強(qiáng)）、AGAAGGAGAT（天然，強(qiáng)度較低）和ATCCGACCAT（最弱）。四種啟動子長度和eyfp側(cè)三種RBS的組合產(chǎn)生了4×3=12種不同的引物。這種設(shè)計(jì)策略總共包括9×12=108種不同的Lrp生物傳感器變體。
每種變體都可以通過單個 PCR 反應(yīng)構(gòu)建，并且所有 PCR 反應(yīng)都可以使用相同的 PCR 模板，即質(zhì)粒 pJC1- lrp - brnF′ - eyfp。為了組裝生物傳感器質(zhì)粒，每個 PCR 反應(yīng)之后都會進(jìn)行雙片段 Gibson 組裝，其中 PCR 產(chǎn)物被組裝到 pEC-Tmob18- lrp - eyfp主鏈中；所有 PCR 產(chǎn)物都經(jīng)過設(shè)計(jì)，因此它們可以組裝到相同的主鏈中。

大腸桿菌的DNA組裝與轉(zhuǎn)化
在構(gòu)建 Lrp 生物傳感器變體之前，通過將lrp和eyfp插入可移動的 pEC-Tmob18 骨架來構(gòu)建骨架質(zhì)粒。在兩個基因之間插入一個包含兩個 NcoI 限制位點(diǎn)的短間隔區(qū)。此序列允許質(zhì)粒線性化，并在下一步中插入包含不同lrp起始密碼子、lrp RBS、brnF啟動子長度和eyfp RBS 的不同版本的序列變體。
108 種變體中，96 種被選為自動克隆工作流程的應(yīng)用示例，因?yàn)榇蠖鄶?shù)自動化設(shè)備都是為 96 孔多滴定板設(shè)計(jì)的。PCR 變體構(gòu)建、Gibson 組裝和大腸桿菌熱休克轉(zhuǎn)化連續(xù)進(jìn)行。Opentrons OT-2 能夠在 85 分鐘內(nèi)自動移液 96 個 PCR 反應(yīng)，然后將平板手動轉(zhuǎn)移到熱循環(huán)儀中。熱循環(huán)后，使用 OT-2 混合 96 個 Gibson 組裝反應(yīng)，這需要 50 分鐘。通過手動將平板轉(zhuǎn)移到熱循環(huán)儀進(jìn)行孵育。在 50 °C 孵育步驟之前對 Gibson 主混合物進(jìn)行適當(dāng)冷卻至關(guān)重要；否則，就無法獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。在我們的工作流程中，冷卻是通過將所有實(shí)驗(yàn)室器皿放入裝滿冰的 3D 打印小盒子中實(shí)現(xiàn)的。大腸桿菌熱休克轉(zhuǎn)化是在 TECAN EVO200 液體處理機(jī)器人上進(jìn)行的，該機(jī)器人實(shí)現(xiàn)了完全無人操作的過程，從 Gibson 組裝混合物和感受態(tài)細(xì)胞開始，到將細(xì)胞點(diǎn)在瓊脂板上準(zhǔn)備過夜孵育結(jié)束。這個過程耗時 170 分鐘?？偣苍?8 小時內(nèi)完成了 96 個構(gòu)建體的 PCR、Gibson 組裝和轉(zhuǎn)化，僅需 40 分鐘的手動操作時間。
實(shí)施熱激步驟的合適方法是將 V 型底 96 孔板放在加熱裝置上預(yù)熱，將 8 種細(xì)胞-質(zhì)?；旌衔飶睦鋮s載體一次一個地轉(zhuǎn)移到加熱板上，孵育 30 秒，然后將其轉(zhuǎn)移回冷卻載體。雖然將整個板從冷卻載體轉(zhuǎn)移到加熱裝置更快，但這會產(chǎn)生不太可靠的熱傳遞結(jié)果。通過離心濃縮細(xì)胞懸浮液，將其重新懸浮在 LB 培養(yǎng)基中，然后點(diǎn)在瓊脂板上，即通過在單個瓊脂板的同一行上移取 6 個 5 μL 的點(diǎn)。
此外，使用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（NEB 5-alpha 感受態(tài)大腸桿菌）和 pUC19 標(biāo)準(zhǔn)載體測試了熱休克轉(zhuǎn)化的參數(shù)。測試了熱休克溫度（37、42 和 47 °C）和熱休克持續(xù)時間（0 到 30 秒，步長為 5 秒）。令人驚訝的是，在每種條件下都成功轉(zhuǎn)化的情況下，菌落形成單位幾乎沒有差異。最終，選擇了與標(biāo)準(zhǔn)手動程序最相似的條件。