在探索高通量測序（NGS）的廣闊領(lǐng)域中，文庫定量作為確保測序數(shù)據(jù)質(zhì)量與深度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，扮演著至關(guān)重要的角色。這一步驟不僅關(guān)乎實驗的成功與否，還直接影響到后續(xù)生物信息學(xué)分析的準(zhǔn)確性和可靠性。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，文庫定量的方法日益多樣化，每種方法都各具特色，適用于不同的實驗場景和需求。

文庫定量

一、文庫定量的重要性
1、確保測序數(shù)據(jù)質(zhì)量：文庫定量可以確保測序儀上載入的DNA文庫量適中，從而避免文庫濃度過高導(dǎo)致的低質(zhì)量測序數(shù)據(jù)或文庫濃度過低導(dǎo)致的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量不足。
2、穩(wěn)定產(chǎn)出各樣本數(shù)據(jù)量：在多個文庫合并測序時，文庫定量有助于根據(jù)測序數(shù)據(jù)量的要求混合相應(yīng)摩爾量的文庫，以穩(wěn)定產(chǎn)出各樣本數(shù)據(jù)量。

二、常見方法
1、紫外分光光度法
（1）原理：核酸（包括DNA和RNA）中的堿基含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，因此具有紫外吸收的特性。核酸的紫外吸收峰在260nm處，與此同時，還能通過計算A260/A280和A260/A230的數(shù)值，估計核酸的純度（280nm吸光通常來自蛋白質(zhì)，而230nm則通常來自糖類和苯酚等）。
（2）缺點：無法區(qū)分DNA和RNA，因為具有紫外吸收的結(jié)構(gòu)是核酸的堿基，而DNA和RNA均含有堿基，因此當(dāng)一份樣品同時含有DNA和RNA的時候，測定濃度會高于其真實濃度。
2、熒光染料法
（1）原理：使用靶標(biāo)特異性染料，該染料可以特異地與不同種類的核酸鏈相結(jié)合，并在特定波長光源的激發(fā)下發(fā)出熒光。其中，結(jié)合了核酸的熒光染料相比那些游離的，信號可增幅數(shù)十倍至數(shù)百倍，因此可以和背景區(qū)分開來。
（2）操作：將待測DNA樣品與熒光染料混合，熒光染料會與DNA結(jié)合，形成熒光復(fù)合物。然后將混合物放入Qubit測量儀器中，儀器會通過激光激發(fā)熒光復(fù)合物，使其發(fā)出熒光信號。Qubit測量儀器會根據(jù)熒光信號的強(qiáng)度自動計算出DNA的濃度。
（3）優(yōu)點：靈敏度高，操作簡便快速，檢測流程高效，可以輕松地分析數(shù)十個樣本，內(nèi)置的分析軟件簡化了數(shù)據(jù)計算，在檢測結(jié)束后立即呈現(xiàn)文庫濃度。
（4）缺點：當(dāng)樣本增加到20~30個以上時，此種檢測方法不太適用；檢測的準(zhǔn)確度略低，結(jié)果一般不作為終濃度用于上機(jī)。
3、實時熒光定量PCR法（qPCR）
（1）原理：利用熒光檢測技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過實時監(jiān)測整個PCR過程中熒光信號的變化情況，反映濃度的變化，最后通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算未知樣品的濃度，以達(dá)到準(zhǔn)確定量文庫濃度。
（2）優(yōu)點：特異引物僅會定量兩端接頭連接完整的文庫，可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫的干擾，準(zhǔn)確度高，是目前業(yè)內(nèi)進(jìn)行文庫定量推薦的方法，適用于測量珍貴樣本以及文庫上機(jī)pooling前的精準(zhǔn)定量。
（3）缺點：成本較高。

三、技巧
1、消除和避免核酸污染：文庫定量使用的Standards濃度從高到低，高濃度Standards容易對環(huán)境造成核酸污染，從而影響陰性對照和低濃度Standards的結(jié)果。因此，做文庫定量的實驗室需要定期除核酸?？梢栽趯嶒灱夹g(shù)后，用紫外處理，將環(huán)境中的核酸氧化。
2、文庫稀釋驗證：文庫建議稀釋2個梯度，相互驗證。說明書上建議是10000倍和20000倍，在具體實驗操作時設(shè)置2個梯度濃度相差10倍也可以。要注意的是10000倍和20000倍得出的Ct值的差應(yīng)該為1附近，可以在0.951.05之間，10000倍和100000倍得出的Ct值差在3.34附近，可以在3.23.5之間，如果超出這兩個區(qū)間，則2個梯度的誤差會比較大，這種誤差有可能是稀釋不準(zhǔn)引起。
3、排除擴(kuò)增效率影響：當(dāng)計算的結(jié)果出來，發(fā)現(xiàn)文庫稀釋成2個梯度所獲得的濃度偏差較大時，可能是由于稀釋不準(zhǔn)，或者該文庫的擴(kuò)增效率較低，導(dǎo)致△Ct偏大。此時，可以將這個文庫做4~5個10倍稀釋梯度，上機(jī)，根據(jù)上機(jī)的Ct值計算擴(kuò)增效率，從而排除擴(kuò)增效率的因素。

文庫定量作為高通量測序流程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其重要性不言而喻。通過合理選擇定量方法和靈活應(yīng)用定量技巧，科研人員能夠更加精準(zhǔn)地掌握文庫的質(zhì)量信息，為后續(xù)的生物信息學(xué)分析和科學(xué)研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

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